? Food Science & Technology Engineering
Food Science & Technology Engineering
وبلاگ تخصصي مهندسي كشاورزي - علوم و صنايع غذايي

2-1- آب آشاميدني : آب گوارائي است كه عوامل فيزيكي , شيميائي و بيولوژيكي آن در حدي باشد كه مصرف آن عارضه سوئي در كوتاه مدت و يا دراز مدت در انسان ايجاد نكند .

 2-2- دريافت مجاز روزانه : عبارتست از حداكثر مقدار دريافت روزانه يك تركيب براي تمام عمر كه بر مبنأ دانسته‏هاي موجود هيچگونه خطري همراه نخواهد داشت .

 2-3- آفت كشها : اصطلاح آفت كشها شامل حشره كشها , علف هرز كشها , قارچ كشها و موش كشها ميباشد .

  3- نمونه برداري

 3-1- نمونه برداري از آب آشاميدني جهت آزمونهاي روزمره بايد طبق استاندارد شماره 2348 ايران انجام پذيرد .

 3-2- در موارد خاص , نمونه برداري از آب آشاميدني بايد طبق استاندارد شماره 2347 ايران انجام گيرد .

  4- ويژگيها

 4-1- ويژگيهاي باكتريولوژيكي آب : ويژگيهاي باكتريولوژيكي آب آشاميدني در دست تهيه ميباشد .

 يادآوري : با توجه به اينكه در هنگام عبور آب در لوله‏ها امكاناتي جهت آلودگي وجود دارد لذا دو نكته اساسي بايد مورد توجه قرار گيرد  الف : فشار آب درون شبكه لوله كشي بايد در كليه قسمتها بنحوي حفظ گردد كه امكان انتقال , الودگي از خارج بدرون لوله‏ها فراهم نگردد . ب : ميزان كلر باقيمانده بايد در حدي باشد كه آلودگيهاي اتفاقي در شبكه را از بين ببرد در  حال حاضر كلر باقيمانده بين2/ تا 8/ معين گرديده است

                                                 (3)

               

                      نوع و نحوه آزمايشات كنترل كيفي

-      محيط هاي كشت هاي ميكروبي :

-   تعريف محيط كشت: به مجموعه موادي اتلاق مي شود كه بتواند غذاي لازم وكافي ارگانيزم ها را تا مين نمايد محيط هاي كشت داراي مشخصاتي است كه بايد به آنها توجه شود .

-      شرايط لازم در محيط هاي كشت :

-       1-  وجود انواع ومقادير انواع غذا جهت تامين انرژي وترميم ورشد ميكرو ارگانيزم ها

-       2-  غلظت مواد محلول بايد در حدود واندازه اي باشد كه براي باكتري زيان آور نبا شد

-       3  - مواد غذايي باكتري ها بايد داراي PH مناسب براي رشد باكتري مي باشد

-   4- اين مواد بايد داراي قابليت استريل شدن و نگهداري آن در محيط مناسب بدون اينكه ارزش غذائي آن از دست برود باشد

محيط هاي كشت ميكروبي كه در آزمايشگاه اردستان استفاده مي شود:

1- محيط كشت لاكتوز براث LactoseBroth

اين محيط به منظور استفاده براي تشخيص كليفرم ها در آب و فاضلاب بكار برده مي شود اين محيط از نظر شكل فيزيكي مايع بوده كه در لوله هاي آزمايش تقسيم مي شود .

پودر حاضر توسط كارخانه سازنده تهيه شده و به بازار عرضه گرديده است اين محيط در دو غلظت   ضعيف وقوي (13گرم درليتر و 26 گرم در ليتر)تهيه و مورد استفاده قرار مي گيرد  پس از تهيه محيط كشت در غلظت هاي ياد شده آن رادر لوله هاي آزمايش بزرگ دورهام دار به مقدار 10 ميلي ليتر(قوي)و در لوله هاي متوسط بقدار 10 ميلي ليتر (ضعيف) تقسيم مي نمايند و پس از مسدود نمودن درب لوله هاباپنبه ودر پوش آلومينيومي آنها را در ظرف مناسب( سبد سيمي) قرار داده و در اتوكلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتيگراد بمدت 15 دقيقه آنهارا استريل نموده پس از سرد شدن در يخچال نگهداري مي شود لوله ها ئيكه به اين منظور تهيه شده اند بايد طوري انتخاب شوند كه پس از ريختن محيط كشت درون آنه بمقدار لازم بيش از نصف لوله را اشغال ننمايد

                                                                    (4)

                                                     

 

 

2- محيط كشت برليان گرين بيل براث Brilliant green bile broth 2%

اين محيط كشت نيز جهت آزمايش تائيدي آب و فاضلاب استفاده مي شود رنگ اين محيط سبز است و به آن محيط كشت سبز درخشان نيز مي گويند اين پودر توسط كارخانه هاي سازنده تهي گرديده و در بازار موجود است براي تهيه محيط آماده مقدار 40 گرم پودحاضر را در يك ليتر آب مقطر حل كرده ودر لوله هاي متوسط دورهام دار بمقدار 10 ميلي ليتر پس از پنبه گذاري وغلاف آلومينيومي در حرارت 121 درجه سانتي گراد بمدت 15 دقيقه آن را استريل نموده و در يخچال نگهداري مي كنيم اين محيط بصورت مايع باشد

3-محيط كشت E.M.B (Eosin Methylen Blue Agar)

اين محيط جهت كشت اختصاصي كليفرمها مناسب است محيطي  جامد به رنگ بنفش و كلني هاي E-coli روي اين محيط به رنگ سبز مايل به بنفش يا جلاي فلزي ظاهر مي شود كه به وضوح قابل رويت است پودر آماده توسط كارخانه هاي سازنده تهيه شده و به بازار ارائه گرديده است طبق دستور كارخانه سازنده مقدار لازم از پودر مزبور رادر يك ليتر آب مقطر ريخته آن را بخوبي مخلوط نموده سپس آن را حرارت داده تا آگار آن بخوبي حل شود .

آن را در اتوكلاو بمدت 15 دقيقه و حرارت 121 درجه سانتي گراد استريل كرده پس از سرد شدن تا حدود 45 درجه سانتي گراد بقدار 25 ميلي ليتر در پليت هاي استريل شده تقسيم نموده پس از خنك شدن  و منعقد شدن محيط آن را به صورت وارونه در يخچال نگهداري نمائيد از اين محيط جهت كشت خطي و تشخيص اي كلي و كلبسيلا استفاده مي شود

4- محيط كشت آردوآ آگارR2A.Agar

اين محيط كشت براي روشspread plate وpour plate  استفاده مي شود. اين محيط كشت با مواد مغذي كم شمارش كلني بيشتري را نسبت به محيط كشت با مواد مغذي زياد نشان مي دهد .

Ph را با محلول k2hpo4يا kh2po4 جامد قبل از اضافه كردن آگار در حد 2/7 تنظيم مي كنند. براي حل شدن آگار محيط كشت را حرارت داده و در 121 درجه ي سلسيوس به مدت 15 دقيقه سترون مي كنيم                                   

                                                                          (5)                                                       

                                                                   

روش هاي انجام آزمايشات كنترل كيفي

شمارش احتمالي كليفرم ها-M.P.N(most probable number)

انديس m.p.n با استفاده از روش چند لوله اي : گروه كليفرمها باكتريهاي هوازي و بيهوازي اختياري- گرم منفي- بدون اسپور و ميله اي شكل هستند كه قادرند لاكتوز را در فاصله 48 ساعت در حرارت 5/+ - 35 درجه سانتي گراد تخمير نموده و ايجاد گاز نمايند. آزمايش كلي فرم ها را به دو روش لوله هاي تخميري شامل آزمايش هاي احتمالي – تائيدي-  تكميلي انجام داد و يا با روش ممبران فيلتر كه در اين صورت كلي باكتري هاي هوازي و بيهوازي اختياري گرم منفي بدون اسپور – ميله اي شكل كه قادرند كلني هاي تيره رنگ در فاصله 24 ساعت روي محيط كشت Endo Agarكه لاكتوز اضافه شده توليد نمايد.

                                         آزمايش استاندارد M.P.N

1-   تست احتمالي Persumptive.test

محيط كشت مورد استفاده لاكتوز براث مي باشدكه پودر حاضر بصورت تجارتي در بازار وجود دارد آن را برابر دستورالعمل كارخانه سازنده تهيه نموده در لوله هاي آزمايش تقسيم كرده و در هر لوله يك لوله دورهام بصورت وارونه داخل آن قرار مي دهيم و آن را استريل كرده و در يخچال نگهداري مي كنند.

 

 

روش آزمايش:

 انجام آزمايش با روش 9 لوله اي مي باشد.

ابتدا سه لوله از محيط هاي كشت لاكتوز براث قوي( 26/gr/lit) كه حاوي 10 ميلي ليتر محيط كشت لاكتوزبراث در سمت چپ جا لوله آزمايش قرار مي گيرد پس از آن شش لوله ديگر از محيط كشت لاكتوز براث ضعيف (13/gr/lit) هر لوله محتوي 10 ميلي ليتر محيط كشت در كنار آنها قرار دارده و از نمونه مورد آزمايش كه به صورت استريل تهيه شده و آن را به خوبي مخلوط نموده ايم و به صورت يكنواخت در آمده است با پيپت استريل به ترتيب از چپ به راست در هر يك از سه لوله اول 10 ميلي ليتر نمونه اضافه كرده و به هر يك از سه لوله بعدي يك ميلي ليتر و به هر يك از سه لوله آخر 1/0 ميلي ليتر نمونه مورد آزمايش اضافه كرده كليه اين عمليات بايد در شرايط استريل و با دقت انجام شود كه از آلودگي هاي ثانوي مبرا باشد. لوله ها كمي به آرامي حركت داده تا نمونه و محيط مخلوط شود در لوله هاي دورهام نبايد هيچگونه گاز يا حبابي از هوا وجود داشته باشد سپس آن را در اتو 5/0+ - 35 درجه سانتيگراد به مدت 24 ساعت قرار مي دهيم

                                                           (6)

     در صورتيكه در تمام لوله هاي دورهام گاز توليد شده باشد آن را مثبت تلقي كرده  و اگر تعدادي يا همه آنها فاقد گاز بودند آن را براي مدت 24 ساعت ديگر در اتو باقي مي گذاريم پس از انقضا مدت مجدداٌ لوله ها را بازديد كرده و موارد مثبت يا منفي را يادداشت مي نمايند  وجود گاز پس از 48 ساعت دليل بر مثبت بودن آزمايش است و اگر در هيچيك گازي مشاهده نشد آزمايش احتمالي منفي است در مورد تخمين تعداد كليفرم در صورت مثبت بودن براي 100 ميلي ليتر نمونه آب به جدول مربوطه مراجعه نموده و تعداد احتمالي كليفرم را تعيين مي نمائيم بايد توجه داشت زماني آزمايش مثبت از اطمينان بيشتر برخوردار است كه در اكثر لوله ها گاز توليد شده باشد.

نحوه گزارش: پس از استخراج عدد m.p.n  از جدول مراتب عيناٌ گزارش مي گردد. بطور مثال انديسp.n .m در نمونه مثلاٌ   A برابر است با 11 كه معني و مفهوم آن اين است كه محتمل ترين تعداد در 100 ميلي متر نمونه 11 باكتري مي باشد. چنانچه جدول در اختيار نداشته باشيم و يا شمارش مثبت ها با جدول مطابقت نكند (در جدول نگنجد) مي توان از اين رابطه مقدار M.P.N را محاسبه نمود:

تعداد لوله هاي مثبت ضربدر 100 تقسيم بر راديكال مضروب ميلي ليتر نمونه در لوله هاي منفي و ميلي ليتر نمونه در تمامي لوله ها

    2- روش آزمايش تاييدي : در اين روش از محيط كشت Brelliantgreen BileBroth    استفاده مي شود اين محيط را نيز طبق دستور كارخانه سازنده در لوله هاي آزمايش حاوي دورهام و محيط كشت مزبور كه قبلاٌ تهيه و استريل گرديده استفاده مي شود . انجام آزمايش تاييدي منوط به مثبت بودن آزمايش M.P.N  است كه در مقابل هر لوله مثبت لاكتوز براث حاوي گاز در لوله دورهام آن يك لوله برليان گرين در مقابل آن قرار داده و در شرايط استريل و با دقت يك تا دو قطره از محيط لاكتوز براث مثبت به محيط كشت برليان گرين بيل براث اضافه نموده آن را در دماي 5/0 +-35 به مدت 48 ساعت در انكو باتور قرار داده در صورت ايجاد گاز در لوله هاي دور هام محيط كشت برليان گرين آزمايش مثبت تلقي شده يعني مراحل قبلي تا ييد مي گردد .

     3-  آزمايش تكميلي   completed   test

اين آزمايش نيز پس از مثبت بودن آزمايش تاييدي انجام مي گيرد  

   روش آزمايش : از كليه لوله هاي مثبت در آزمايش تاييدي به صورت روش خطي بر روي

                                                            (7)

 محيط كشت E.M.Bكشت داده مي شود پس از انجام كشت آن را براي مدت 2+ - 24 ساعت در اتو 5/0 + - 35 درجه سانتي گراد قرار داده كلو ني هاي رشد كرده روي اين محيط شكل هاي  1-مشخص 2- غير مشخص 3 - منفي تقسيم مي شود

1- كلني هاي مشخص  Typical  به صورت هسته دار و جلاي فلزي يا بدون جلاي فلزي مي باشد

2-   كلني هاي غير مشخص بدون هسته با رنگ مات كه بعد از 24 ساعت صورتي رنگ مي شوند  

3-  ساير كلني هاي موجود منفي تلقي مي شود در بيان نتايج لا مشاهده كلني هاي هسته دار با جلاي فلزي گزارش اشيرشيا كلي وديدن كلني هاي صورتي رنگ روي اين محيط كلبيسلا گزارش مي شود براي اطمينان بيشتر  از هر جعبه پتري محتوي كشت يك يا چند كلني مشخص انتخاب كرده در يك لوله محتوي محيط لاكتوز براث حاوي لوله دورهام كشت داده و قسمتي نيز روي محيط كشت Natural Agar   پس از مدت 24 تا 48 ساعت در اتو 35 درجه سانتي گراد لوله هاي حاوي لاكتوز براث داراي گاز در لوله دورهام مثبت تلقي مي شود واگر از محيط كشت نوترين آگار فروتي تهيه شود وآن را با رنگ گرم رنگ آميزي نمائيد وجود باسيل هاي گرم منفي بدون اسپور  دليل بر وجود كلي فرم ها مي باشد در اين صورت آزمايش تكميلي مثبت است.

اعلام  نتيجه آزمون ميكروبي :

در آزمايشگاه  ميكروبي آب و فاضلاب روستائي اردستان كليفرم گرماپاي با واحدml100 / MPN  احتمالي  و تاييدي بيشتر از 2/2  و نوع ميكروب E.coli   يا kellebsilla  گزارش مي شود و در صورت عدم  توليد گاز و بون تغيير ماندن رنگ در مرحله احتمالي يا احتمالي عدم وجود كلي فرم ها گزارش مي شود

همچنين در اعلام نتايج آزمون ميكروبي تعداد جمعيت ميكروبي (HPC) با واحد (cfu/ml  ) گزارش مي گردد. كه در صفحه بعد نوع محيط كشت و روش اجرائي بيان مي گردد                          

                                                               (8)        

آزمايش HPC (شمارش ميكرو ارگانيسم هاي هترو تروف)

شمارش ميكرو ارگانيسم ها ي هتروتروف كه پيش از اين تحت عنوان شمارش پليت استاندارد شناخته مي شد – روشي است كه توسط آن تعداد باكتري هاي  هتروتروف زنده در آب اندازه گيري شده و جزء تغييرات كيفي به هنگام تصفيه و توزيع آب و يا كيفيت آب استخرهاي شنا بررسي مي گردد . كلني هاي مورد مطالعه با اين روش مي توانند به صورت دوتايي – زنجيره اي- خوشه اي و يا منفرد تشكيل شوندكه همه انواع آن تحت عنوان واحد هاي تشكيل دهنده كلني (CFU ) ناميده مي شوند .شمارش نهايي به مقدار موثر انتشار كلني بستگي دارد از اين رو روش كار و محيط كشت به گونه اي بايد انتخاب شود كه بتواند بيشترين تعداد كلني را در مدت معيني از گرماگذاري توليد كند در حال حاض سه روش و 4 محيط كشت وجود دارد كه بيان مي گردد:

روش هاي 1- پور پليت 2- كشت سطحي يا اسپريد پليت 3- صافي غشايي يا ممبران فيلتر

محيط هاي كشت : Plate count agar-1 2-m HPC Agar   3-R2A Agar 4- NWRI Agar(HPCA)

روش پورپليت : مقدار1/0 تا 1 ميلي ليتر از نمونه يا نمونه اي رقيق شده كه به وسيله ي پيپت به پليت سترون اضافه و سپس محيط كشت آگار مذاب را مي افزاييم و پس از مخلوط شدن بايد سرد و منجمدگردد سپس گرماگذاري شده و شمارش كلني انجام مي گردد.

روش كشت سطحي : مقدار 1/0 يا 5/0 ميلي ليتر از نمونه يا 1/0 يا 5/0 ميلي ليتر از رقت مناسب نمونه به محيط كشت حاوي آگار جامد شده موجود در پليت اضافه مي شود . نمونه ي تلقيح شده  بر روي سطح محيط كشت را با يك ميله شيشه اي سترون به صورت يكنواخت پخش مي گردد.در اين روش همه كلني ها بر روي سطح محيط كشت به وجود آمده و مانع از نفوذ كلني ها به داخل آگار مذاب مي شود . پس از گرماگذاري در دما زمان مناسب – كلني هاي باكتري ها را بر روي سطح آگار شمارش مي نمايند

روش صافي غشايي : اين روش در مورد نمونه هاي آب با حجم زياد و كدورت كم و معمولاٌ براي آب هايي با احتمال شمارش كلني (كمتر از Cfu/ml 10- 1) به كار مي رود اين روش شوك گرمائي ايجاد نمي كند و هزينه هاي آن براي تهيه صافي هاي غشايي بيشتر از دو روش  ديگر برشمرده مي شود

                                                          (9)

روش كشت سطحي (Spread Plate):

1- پليت ها را به ترتيب چيده و علامت گذاري مي نمائيم .پليت شاهد – دو سري پليت براي هر نمونه مورد آزمايش و نمونه كنترل مثبت براي يك سري از نمونه ها تهيه مي كنيم. براي كنترل شرايط سترون از 1/0 ميلي ليتر آب رقيق سازي سترون استفاده مي گردد.اين كار براي اطمينان از سترون بودن پيپت – آگار ورقيق سازي انجام مي گيرد

2-   نمونه ها را رقيق سازي مي نمائيم

3-    براساس نمونه ها و رقت ها پليت ها را مرتب مي نمائيم

4- نمونه هاو رقت ها را قبل از اينكه با استفاده از پيپت به داخل پليت منتقل كنيم بايستي به شدت تكان داد

5-  در حالي كه پليت را مي چرخانيد نمونه يا حجم رقيق شده (1/0 يا5/0 ميلي ليتر رابا استفاده از پيپت روي سطح محيط آگار جامد مي ر يزيم

6-  نمونه تلقيح شده را روي سطح محيط كشت با استفاده از ميله شيشه اي سترون به طور يكنواخت پخش كنيد اين كار با ثابت نگه داشتن ميله شيشه اي بر روي سطح آگار و حركت دادن پليت و يا با حركت دادن ميله شيشه اي بر روي سطح محيط كشت انجام مي شود در اين روش همه كلني ها بر روي سطح محيط كشت شكل مي گيرند

7-   قبل از گرماگذاري اجازه مي دهيم تا نمونه تلقيح شده بطور كامل در محيط كشت جذب شود

8-  وقتي سطح محيط كشت آگار خشك شد درب پليت ها را بسته آنها را بطور وارونه براي انجام آزمايش هاي اختصاصي به مدت 48 ساعت در  حرارت 35 درجه سلسيوس قرار مي دهيم پس از گرماگذاري در دما و مدت زمان مناسب كلني هاي مجزا بر روي سطح محيط كشت پديدار مي شوند

محاسبه و گزارش نتيجه ي آزمايش:

براي محاسبه ي شمارش پليت – كل كلني هاي شمارش شده و يا ميانگين آن ها(در موردپليت هاي دوتائي از يك ضريب رقت يكسان ) در هر پليت در عكس ضريب رقت ضرب مي شود. بهتر است ابتدا تا دو رقم معني دار (دو رقم سمت چپ ) گرد شده سپس بصورت Cfu/ml گزارش شود

                                                    (10)  

äæÔÊå ÔÏå ÏÑ ÊÇÑíÎ ۲۷ آذر ۱۳۸۸ ÊæÓØ امير ملك خرّمي | äÙÑÇÊ (0)